美容---皮肤养生学 │ 2010-04-07 20:28:41

第四节 抗皱紧致肌肤化妆品功效评价方法

一、抑制MMP活性实验

1、实验原理：实验所用底物为荧光底物，酶降解底物后产物发荧光，通过荧光酶标仪检测反应体系的荧光强度变化，荧光底物的激发波长为460 nm,发射波长为520 nm。抑制活性的测定是在反应体系中加入植物活性成分，提取物中抑制成分与酶结合，占据酶的活性中心，使底物不能与酶结合，从而导致酶降解底物速率降低，荧光强度变化减慢。

2、实验试剂：待测植物活性成分，自制缓冲溶液(50 mmol/L HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）,0.2 mol/L NaCl,10 mmol/L CaCl₂,20μmol/L ZnSO₄ ,0.05% Brij-35)，荧光底物DQ-gelatin，已知广谱MMP的抑制药物15mmol/L 的GM6001。

3、实验仪器：荧光酶标仪、点热恒温培养箱

4、实验方法：将一定量的MMP-1分别与1uL不同浓度的待测液，1uL无菌水，1uL 15nmol/L 的GM6001 加入96孔酶标板中，然后加入缓冲溶液（50mmol/L HEPES, 0.2 mol/L 的NaCl，10 mmol/L的CaCl₂，20 umol/L的ZnSO₄ ，0.05% Brij-35），使终体积为50uL，放入37培养箱中孵育30 min，然后加入含有 0.2ug DQ-gelatin的缓冲溶液50uL,最终反应体系为100uL。立即用Bio-Red FLx-800 荧光酶标仪进行检测，激发波长为460 nm,发射波长为520nm，检测10 min。检测的荧光强度变化就代表酶降解底物活力的强度。

5、结果分析:

MMP-1抑制百分数(%)=（1-Vi/Vo ）×100%

Vi—代表添加植物活性成分组的荧光强度

Vo—代表没有添加植物活性成分组的荧光强度

二、修复细胞膜实验

1、实验原理：在细胞膜层，氧化压力首先引起磷脂的过氧化。在体外实验，用过氧化亚油酸模拟磷脂过氧化的产物和小牛血清白蛋白（BSA）作为反应实验模型，其反应产物用高效液相色谱（HPLC）法进行分析。在反应体系中加入植物活性成分，检测其修复细胞膜的功效。

2、实验试剂：过氧化亚油酸（LOOH）、小牛血清（BSA）、待测植物活性成分

3、实验仪器：恒温箱、高效液相色谱仪（HPLC）

4、实验方法：

（1）配制浓度为3mmol/ml、6mmol/ml、15mmol/ml的过氧化亚油酸水溶液各10ml；

（2）配制浓度为30nmol/ml的小牛血清（BSA）水溶液10ml；

（3）配制不同浓度的植物提取物（0.05%、0.1%、0.2%等）10ml；

（4）将配好的溶液按一定配比混合，混合顺序依次是BSA→药品→过氧化亚油酸；

（5）等浓度的植物提取物作为进行HLPC的空白体系。（同时做好CH₃COOOH溶液、BSA溶液的空白分析。

（6）配好的反应液在37℃下孵育3h；

（7）反应产物进行稀释（约稀释100-1000倍左右），用HPLC法进行分析，检测植物提取物是否能够把过氧化亚油酸还原为无毒的醇类，从而起到保护细胞膜的作用

三、蛋白质保护实验

SDS-PAGE方法分析活性成分对蛋白降解的保护作用

1、实验原理

离子型去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）可与蛋白质作用，破坏蛋白质分子的非共价键，使蛋白质变性，失去原有的空间构象，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，使各种蛋白质分子间只保持着分子大小的差异，彼此间原有的电荷差异被消除或大大降低。当SDS 被引入聚丙烯酰胺凝胶系统并进行电泳时，样品中蛋白质原有的电荷差异已不起作用，蛋白质分子在电场中的迁移速度仅取决于各自分子的大小，从而得到分离。SDS 与蛋白质按重量比的关系进行结合。当SDS 浓度大于1 时，大多数蛋白质和SDS 的结合比例为1：1.4 。用考马斯亮蓝（CBB）对十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶进行染色，然后快速脱色，常用混合床树脂或其它材料来吸附从染色凝胶扩散出来的游离染料。对脱色凝胶进行扫描，其中吸光值与结合染料的量成正比。

2、实验试剂

（1）0.2mol/L、pH 7.2 的磷酸盐缓冲液：取0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液280ml，加入0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液720 ml，混匀后在pH 计上调至pH 7.2。

（2）样品溶解液0.01mol/L、pH7.2 磷酸缓冲液，内含1%SDS，1%巯基乙醇，10%甘油，0.02% 溴酚蓝，用来溶解蛋白质样品。将SDS 100mg，巯基乙醇 0.1ml，甘油 1ml，溴酚蓝 2mg，0.2mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液 0.5 ml，加蒸馏水至总体积10 ml即可。

（3）电极缓冲液：0.1%SDS，0.1mol/L、pH7.2 磷酸缓冲液。取1g SDS，加入500 ml 0.2mol/L、pH 7.2 的磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000 ml。

（4）染色液：0.25 g 考马斯亮蓝R-250，加入50%甲醇水溶液454 ml 和冰乙酸46 ml。

（5）脱色液：75ml 冰乙酸，875ml 蒸馏水与50 ml 甲醇混合。

3、实验仪器

（1）电泳槽：垂直电泳槽；

（2）凝胶电泳玻璃管：内径5-6mm，外径7-8mm，长100mm，两端用金刚砂磨平；

（3）小玻塞：将与凝胶玻璃管直径相同的玻璃棒，两端磨平，同时以乳胶管与凝胶玻璃管相连；

（4）1ml、5ml、10ml 注射器，50ul 或100ul 微量注射器；

（5）凝胶扫描装置。

4、实验材料：待测植物活性成分，SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒，小牛血清白蛋白（BSA），SOD，过氧化亚油酸（LOOH）、MAD。

5、实验方法

（1）贮液及凝胶溶液的配制；

（2）样品制备:配制“样品溶解液”（各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高一倍），将植物活性成分待测液与“样品溶解液”等体积混匀，然后加热，即制得待测植物活性成分样品。处理好的样品溶液即可用于电泳。直径为6mm 的凝胶柱，每管加10ug 蛋白质可得到清晰的区带。根据样品溶液的浓度，加样体积可为10-150ul。

（3）电泳：轻轻取小凝胶管的小玻塞，注意保护垂直装置在电泳槽上。将电泳槽的上槽倾斜过来，使凝胶管口斜向下方，用滴管轻轻吸去流到凝胶管口的水。将电极缓冲液注入小槽，将上槽轻轻放下，稍转动，以除去凝胶管底部可能有的小气泡，也可用带弯头的滴管轻轻吸去。将电极缓冲液注入上槽，没过管口。用微量注射器按号向凝胶管中加样，每管加一种样品，各加20ul。加样完毕，打开直流稳压电源，将电流调至每管8mA。保持电流强度不变，待染料迁移至距下口约1cm 处，停止电泳。

（4）染色、脱色：用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水，插入凝胶与管壁之间。一面轻轻旋转玻璃管，一面推针前进，并注入蒸馏水，使凝胶剥离玻璃管并滑出。在染料区带的中心插入细铜丝作为标志，按编号放入试管，加入染色液，染色4h。倾出染色液，用蒸馏水清洗凝胶数次后加入脱色液，数小时换1 次脱色液，直至背景清晰。

（5）扫描：对脱色的凝胶进行扫描，使吸光值与结合染料的量成正比。

四、皮肤水分流失测试

1、测试仪器：皮肤水分流失测试仪，型号TM300-Tewamater，德国CK电子公司。

2、测试原理：根据A.Fick发现的扩散原理来测量邻近皮肤表面水分蒸汽压的变化。使用特殊设计的两端开放的圆柱形腔体测量探头在皮肤表面形成相对稳定的测试小环境, 通过两组温度、湿度传感器测定近表皮(约1cm以内)角质层水分散失所形成的不同两点间的水蒸气压梯度, 直接测出经表皮蒸发的水分量, 以此来衡量皮肤表面水分流失情况, 从而可以评价化妆品在皮肤表面的保湿功效。

Fick菲克扩散定律：

dM/dT=-D*A*dP/dX

A——面积（m²）           M——水分的扩散量（g）

T——时间（h）            D——扩散常数（0.0877g/m.h.mmHg）

P——蒸汽压力（mmHg）     X—皮肤表面测量点的距离（m）

3、测试范围：用于化妆品保湿功效的测试，测试产品类型有：护肤类膏霜、乳液和啫喱等。

4、试验条件和志愿者

（1）测试环境条件：测试环境温度：21±1℃；湿度：50±5 %，并且进行实时动态监测。

（2）志愿者人数：有效志愿者至少30人。

（3）志愿者条件：年龄在18～65岁之间。无严重系统疾病、无免疫缺陷或自身免疫性疾病者。无活动性过敏性疾病者。既往对护肤类化妆品无过敏史者。近一月内未曾使用激素类药物及免疫抑制剂者。未参加其它临床试验者。志愿参加并能按试验要求完成规定内容者。

（4）志愿者排除条件：妊娠或哺乳期妇女；试验期间全身应用激素类、免疫制剂类药物者； 未按规定使用受试物或资料不全者。

（5）测试前所有志愿者应填写知情同意书。

5、人体测试

（1）测前准备：受测部位应洁净、近期未污染。在所需环境中静坐30min，不喝水，暴露受测部位。标记受测部位，根据科学排列顺序，同一手臂可同时标记多个区域（不可超过3个区域），区域间隔1cm，测试产品和空白对照均随机分布在左右手臂上。

每个区域测定3-5次。先测量各测试区域的空白值，然后按2.0±0.1 mg样品/cm²皮肤的用量涂抹，涂抹后分别测量1小时、2小时、4小时、受试区域和空白对照区域的皮肤水分散失率。同一个志愿者的测试由同一个测量人员完成。

（2）仪器操作：仪器设置CONFIG，Language（语言选择）利用上下箭头↑↓选择适当语言，OK确定和ESCAPE退出。Average Value Calculation 平均值计算时间可从2，4，6，10，20，30，60秒选择，平均值计算时间越长，达到稳定测量的时间就越快，推荐选择20秒。Type of Measurement（测量类型）分为标准测量和连续测量。Printer（打印机设置），从Epson, HP Laserjet or IBM-Proprinter中选择一个型号的打印机，打印机通讯协议要求符合XON/SOFF软件和DTR硬件。ZOOM（屏幕显示尺寸）屏幕显示标尺大小共分为五档。Tolerance（设定TEWL公差值）测量时TEWL值达到公差允许的范围后，一起发出嘟的一声信号，表明仪器已开始了稳定测量。公差按0.05的数值递减，所设数值越大，达到稳定测量的时间就越短，所设数值越小，则精确度高，达到稳定测量的时间就越长。

（3）水分散失测量：测试开始3秒钟内将测试探头放于要测试的人体部位，发出嘟的一声，表明开始测试。每2秒仪器自动采集一次数据，显示在测试曲线上部的左侧，中间为最后20秒的平均值，右边为平均值的偏差。测试中得到的TEWL值总是同CONFIG种Tolerance所设置的平均公差值进行比较，合格稳定后发出嘟的一声提示。大约1～2分钟后TEWL值就稳定了。测量完3～4分钟后TEWL才可能出现零值，这是由于探头内部的温度和湿度不均造成的。

6、数据处理

对皮肤水分含量的测量结果进行统计学分析比较，采用t检验方法进行显著性分析检验，其中p<0.05表示有显著性差异。估计均数的抽样误差可计算该组数据的标准差或标准误。当个别数据偏差较大时，可根据t检验剔除标准进行筛选，如符合标准则可剔除；当剔除后的受试者人数少于30人时，应增加受试者人数直至符合要求。

7、注意事项：每次开机后，机器需要15分钟的预热时间才可进行校准和零点校准；测量环境要求：室温21±1℃，相对湿度40%～60%，相同试验条件的数据才可以进行比较；该仪器TEWAMETER TM300可以直接打印输出结果，但要求打印机必须有串行接口。

五、皮肤纹理度测试

1、测试仪器：多功能皮肤图像分析系统，型号Micro SkinⅡ，MOTIC CHINA GROUP CO.LTD。

2、测试原理：皮肤衰老是机体衰老的一部分，随着年龄增长， 皮肤会出现如下外在表现：皮肤松弛、变薄，皮肤的含水量下降，往往显得干燥，有鳞屑，失去光泽，弹性和紧实度也随之下降，皱纹形成，并逐渐增多，加深。多功能皮肤图像分析系统从化妆品使用前后皮肤的纹理度变化来衡量皮肤的不同老化程度，从而评价防衰老抗皱化妆品对皮肤的延缓衰老作用。

3、测试范围：用于抗皱功效化妆品的测试，本方法的适用产品类型：护肤类膏霜、护肤水类、乳液和啫喱。

4、试验条件和志愿者

（1）测试环境条件：测试环境温度：21±1℃；湿度：50±5 %，并且进行实时动态监测。

（2）志愿者人数：有效志愿者至少30人。

（3）志愿者条件：年龄在18～65岁之间。无严重系统疾病、无免疫缺陷或自身免疫性疾病者。无活动性过敏性疾病者。既往对护肤类化妆品无过敏史者。近一月内未曾使用激素类药物及免疫抑制剂者。未参加其它临床试验者。志愿参加并能按试验要求完成规定内容者。

（4）志愿者排除条件：妊娠或哺乳期妇女；试验期间全身应用激素类、免疫制剂类药物者； 未按规定使用受试物或资料不全者。

（5）测试前所有志愿者应填写知情同意书。

5、人体测试

（1）测前准备：受测部位应洁净、近期未污染。标记受测部位， 同一手臂可同时标记多个区域，区域间隔1cm，测试产品和空白对照均随机分布在左右手臂上。涂抹后分别测量1周、2周、3周、4周后受试区域和空白对照区域的皮肤弹性值，每周按此时间测定。同一个志愿者的测试由同一个测量人员完成。

（2）仪器操作

①接通电源，打开仪器电源开关；

②在电脑桌面上打开多功能图像分析系统软件；

③将软件锁插在电脑USB接口上；

④探头与电脑连接；

⑤纹理度测量；创建档案，在“图像”中选择“图像采集”，打开探头，并调节旋钮至图象清晰，点击“拍照”，在菜单中选择“访问档案”，选择所采集的图像，选择“测量分析”，在新弹出的窗框里选择圆形子区，将虚线覆盖于被测区域，并完全覆盖，双击，电脑自动生成数据，点击窗框中的“存贮”按钮。将仪器放回原位，重新编号，继续下一区域的测量。

6、数据处理

（1）选择“测量分析”，在新弹出的窗框里选择圆形子区，将虚线覆盖于被测区域，并完全覆盖，双击，电脑自动生成数据，点击窗框中的“存贮”按钮，选择储存地址，计算机自动生成txt结果，统计。

（2）对皮肤水分含量的测量结果进行统计学分析比较，采用t检验方法进行显著性分析检验，其中p<0.05表示有显著性差异。估计均数的抽样误差可计算该组数据的标准差或标准误。当个别数据偏差较大时，可根据t检验剔除标准进行筛选，如不符合标准则可剔除；当剔除后的受试者人数少于30人时，应增加受试者人数直至符合要求。

六、皮肤弹性测试

1、测试仪器：皮肤弹性测试仪，型号MPA580，德国柯卡电子有限公司

2、测试原理：皮肤弹性测量原理是基于吸力和拉伸的原理,利用负压装置对皮肤弹性进行测定。仪器包括真空发生器和测试探头。探头内包括光的发射器和接收器组成的非接触式的光学测量系统,光的比率(发射光和接收光之比) 与被吸入皮肤的深度成正比,由此可测得恒定负压时皮肤弹性。

3、测试范围：用于抗皱功效化妆品的测试，本方法的适用产品类型包括护肤类膏霜、护肤水类、乳液和啫喱。

4、试验条件和志愿者

（1）测试环境条件：测试环境温度：22±1℃；湿度：50±5 %，并且进行实时动态监测。

（2）志愿者人数：有效志愿者至少30人。

（3）志愿者条件：年龄在18～65岁之间。无严重系统疾病、无免疫缺陷或自身免疫性疾病者。无活动性过敏性疾病者。既往对护肤类化妆品无过敏史者。近一月内未曾使用激素类药物及免疫抑制剂者。未参加其它临床试验者。志愿参加并能按试验要求完成规定内容者。

（4）志愿者排除条件：妊娠或哺乳期妇女；试验期间全身应用激素类、免疫制剂类药物者； 未按规定使用受试物或资料不全者。

（5）测试前所有志愿者应填写知情同意书。

5、人体测试

（1）测前准备：受测部位应洁净、近期未污染。标记受测部位， 同一手臂可同时标记多个区域，区域间隔1cm，测试产品和空白对照均随机分布在左右手臂上。涂抹后分别测量1周、2周、3周、4周后受试区域和空白对照区域的皮肤弹性值，每周按此时间测定。同一个志愿者的测试由同一个测量人员完成。

（2）仪器操作

①接通电源，打开仪器电源开关；

②在电脑桌面上打开MPA5系统软件；

③将探头的镜头盖（保护镜头）拿下来；

④弹性测量：选择“打开“文件，添加新的测试者是单击“＋”，然后会出现一个空白的界面，系统会自动为该测试者编号。测量可在四种模式下进行：

模式1：在“恒定负压”下的测试   在“on-time”中设置将皮肤吸入探头的时间，在“off-time”设置皮肤松弛的时间。在“Repetition”中可以设置测试的循环次数。模式1的测试是最频繁的。我们建议在各种情况下都进行这项测试，以便计算测试数据。

模式2：在“先线性增加再线性减少的负压”下测试   在测试开始时负压值是零，在测试过程中皮肤会受到先线性增加后线性减少的负压。“Repetition”按钮控制测试的循环次数，负压变动率通过负压最大值和加压时间来设置，但负压变动率不能低于10mbar/s。

模式3：在“先恒定再线性减少的负压”下测试   它是由模式1的前半部分和模式2的后半部分组成的。从“on-time”中设置时间，用负压值与加压时间来设置负压变动率。如果负压值很大但变化率很小，循环测试就不能进行了。

模式4：在“先线性增加然后忽然中断的负压”下测试。

⑤将仪器镜头水平放置于被测区域，确定测量时不会漏光；

⑥1.5s后，电脑自动生成数据，点击窗框中的“存贮”按钮；

⑦将仪器放回原位，重新编号，继续下一区域的测量。

6、数据处理

（1）数据导出：“预览”显示系统中所有被储存着的名字；“查找”：可以查找所有有资料的被测试者的姓名、地址等；“确定”：储存并退出，“取消”：不储存而退出；“以．．．储存”：曲线可以以DOS方式载入CutometerSEM575的曲线；“打印输出”：可以打印结果；“打印预览”：选择这条命令可以看到曲线打印后的效果；“打印报表”以报表的格式打印曲线。

（2）结果计算

模式1（对健康皮肤的解释）：

R0=e(a)=Uf 对应于a的时间的拉伸值。即第一次加负压皮肤被拉伸的最大幅度，它与皮肤的弹性有关。例如：两个气球一个充满气，另一个只充一半气，材料有弹性，充满气的气球更具有弹性，该参数再次说明皮肤对压力值的影响。

R1=e(a+b) 对应于(a+b)时间的拉伸量，即第一次循环结束对皮肤的拉伸量，反映皮肤恢复到最初状态的能力。

R2=(e(a)-e(a+b))/e(a)=Ua/Uf 无负压时皮肤的回弹量与有负压时的最大拉伸量之比，比值越接近１，说明皮肤弹性越好。

R3=e(r*a)+(r-1)*b)最后一次循环结束时皮肤的拉伸量。

R5=(e(a)-e(a+0.1)=Ur/Ue 在皮肤测试的第一次循环中，皮肤恢复过程的弹性部分与加负压过程的弹性部分之比，接近１，说明皮肤弹性越好。

R6=(e(a)-e(0.1))/e(a)=Uv/Ue 在皮肤测试的第一次循环过程中，皮肤的塑性部分和弹性部分之比，数值与小，说明皮肤弹性越好。

R7=(e(a)-e(a+0.1))/e(a)=Ur/Uf 在皮肤测试的第一次循环中，皮肤恢复过程的弹性部分与这次循环过程中皮肤的最大拉伸量之比，接近１，说明皮肤弹性越好。

R8=(e(a)*a*100)/f(a)-1)*100 第一次加负压过程中所形成的曲线，在两根坐标轴和最高拉伸点之间所构成的长方形内，曲线上的部分即塑性部分和曲线下的部分即弹性部分面积之比，数值越小，说明皮肤弹性越好。

R9=c在光标出皮肤被拉伸的数值。

模式2：

R0=e(a)=Uf  对应用a的时间的拉伸量。即第一次加负压皮肤被拉伸的最大幅度。他是皮肤弹性的表示。例如：一个拉的较紧的气球和一个拉的松的气球，虽然材料也具有弹性，但较紧的气球更具弹性。

R1=e(1.5*a)-e(0.5*a)对应于第一次循环过程中某些特定点的差距。这些特定点在P/E模型中显示。差距越大，数值越小，说明皮肤弹性越差。

R2=(e1.75*a)-e(0.25*a)) 对应于第一次循环过程中某些特定点的差距。这些特定点在P/E模型中显示。差距越大，数值越小，说明皮肤弹性越差。

R3=e(2*a)第一次循环结束时的拉伸量。

R5=e((2*r-1)*a+(r-1)*b) 与第一次循环的最大拉伸量相比的最小拉伸量（最后一次循环）。皮肤的疲劳效应是明显的，正如每次加负压时再损伤能力的增加。

R6=e(2*r*a)+b*(r+1) 对应于最后一次循环过程中某些特定点的差距。这些特定点在P/E模型中显示：差距越小，数值越少，皮肤弹性越大。

R7=E(2*R*a+R*b)与第一次循环的最小拉伸量相比的最小拉伸量（最后一次循环）。皮肤的疲劳效应是明显的，正如每次加负压时再损伤能力的增加。

R8=f(a)/e(a)*a*50)-1由Uf和负压时间决定的循环的面积，数值越少，该循环的面积越大，在一次循环下显示的P/E模型的面积时可表达的。

模式3：

R0=e(0.1)=Ue0.1秒后的拉伸量

R1=e(a)最大拉伸量（该循环中的最大值）.他表示皮肤的弹性。例如：一个拉紧的气球和一个放松的气球，不仅材料本身有弹性，而且拉紧的气球更具有弹性

R2=e(a+0.25B)1/4倍无负压的拉伸量

R3=e(a+0.5b)1/2倍无负压的拉伸量

R4=e(a+b) 负压和无负压的拉伸量（最后一次循环）

R5=e(a+b)/e(a)

模式4：

R0=e(a)=Uf最大拉伸量（该循环中的最大值）。它表示皮肤弹性。例如：一个拉紧的气球和一个放松的气球，不仅材料本身有弹性，而且拉紧的皮球更具有弹性。

R1=e(a)-e(a+0.1)+Ur

R2=e(a+b) 循环的最小值

R3=R0

R4=e(r*a+(r-1)*b+0.1)

R5=R2

R6=（e(a)-e(a+0.1)）/e(a)

在皮肤恢复过程的弹性部分与这次循环过程中皮肤的最大拉伸量之比越接近1，说明弹性越好。

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